Whisky - drożdże i fermentacja - szkiełkiem i okiem
: 2018-01-23, 10:15
Temat może nie tak interesujący jak beczki, ale równie ważny, czyli drożdże i fermentacja. Poniżej tłumaczenie rozdziału 4 z książki "Whisky: Technology, Production and Marketing", wydanie z 2003. W niektórych miejscach składnia może być bardziej angielska niż polska, choć starałem się jak mogłem aby zachować sens. Rozdział zawiera dużą dozę "naukowego bełkotu", jedynie dla prawdziwych hobbystów , ostrzegam!
Wstęp
W porównaniu z ilością literatury dotyczącej biochemii i mikrobiologii fermentacji piwa i wina lub popularnej literatury na temat samej whisky, niewiele jest naukowych informacji dotyczących fermentacji szkockiej whisky. Prace przeglądowe Berry'ego i Ramsay'a (1983) oraz Korhola i in. (1989) są jednymi z nielicznych dotyczących tego etapu produkcji whisky. Na szczęście przebieg fermentacji jest podobny w browarze i gorzelni, a dużą ilość informacji dla ogólnego zrozumienia procesu fermentacji można znaleźć w literaturze piwowarskiej (patrz, na przykład, Hough i wsp., 1982, Young, 1996, Boulton i Quain, 2001, Slaughter, 2002). Przeglądy te dostarczają już autorytatywnych wyjaśnień dotyczących fermentacji alkoholowej brzeczki na bazie zbóż, dlatego ten rozdział bardziej dotyczy praktycznych różnic między piwowarstwem a fermentacją w gorzelni i nie podejmuje żadnej próby omówienia destylowanych produktów innych niż szkocka whisky.
Zarówno w destylarniach whisky słodowej jak i zbożowej głównymi źródłami kongenerów w new-make'u są:
Słód i destylowane zboża
Lotne składniki strukturalne drożdży
Metabolity drożdży
Mikrobiologiczne zanieczyszczenia fermentacji.
Chociaż bardziej efektywna rektyfikacja ciągła zmniejsza wkład tych czterech czynników smakowych w porównaniu z wpływem późniejszego dojrzewania, to zarówno drożdże, jak i przebieg fermentacji są ważnymi czynnikami przyczyniającymi się do charakteru tych dwóch rodzajów szkockiej whisky. W rzeczywistości jest to zobowiązanie prawne: przepisy wymagają, aby whisky zachowała aromat i smak pochodzący z fermentacji drożdżowej zacieru ze słodu lub zacieranego słodem zacieru zbożowego.
Drożdże do fermentacji alkoholowej
Nazwa ogólna Saccharomyces (łac. grzyb cukrowy) została po raz pierwszy zastosowana przez Meyena w 1838 roku, ale nowoczesna taksonomia drożdży w przemyśle fermentacji alkoholowej wywodzi się w dużej mierze z pracy Hansena w Carlsberg Laboratories w Danii w latach 80. XIX wieku (Barnett i wsp., 1990). Hansen nadał różne nazwy drożdżom zbierającym się w trakcie fermentacji w górnej części fermentora (drożdże z piw brytyjskich, belgijskich oraz z północy Niemiec) - S. cerevisiae, drożdżom zbierającym się w trakcie fermentacji na dnie fermentora, pracującym w niższym zakresie temperatur fermentacji - S. carlsbergensis oraz posiadającym większą tolerancję na alkohol drożdżom winnym z charakterystycznymi elipsoidalnymi komórkami (S. ellipsoideus). Od tego czasu klasyfikacja była często zmieniana, a obecnie wszystkie trzy z tych dawnych gatunków zostały nazwane S. cerevisiae. Chociaż jest to uzasadnione zasadami taksonomii botanicznej (w tym dotyczącej grzybów), to uciążliwe jest, że drożdże o tak różnych właściwościach przemysłowych nie mają oficjalnych nazw, które pozwoliłyby je odróżnić. Fermentujące skrobię dzikie drożdże oraz zanieczyszczenia browarnicze początkowo wyizolowane jako S. diastaticus są teraz również zawarte w S. cerevisiae.
Początkowo piekarze i gorzelnicy whisky z powodzeniem przeprowadzali fermentację, wykorzystując nadmiar drożdży wytwarzanych przez przemysł piwowarski, ale wyhodowanie odmian o ulepszonych właściwościach dla branży piekarniczej pobudziło równoważny rozwój wyspecjalizowanych drożdży gorzelnianych. Oczywiście drożdże typu ale były ważnym składnikiem hybrydy, ale z powodu swych właściwości amylolitycznych zastosowano również S. diastaticus. W przeciwieństwie do prawie kulistych drożdży piwnych, hybrydy gorzelniane mają eliptyczny kształt o wymiarach o długości około 10 mm i średnicy 5 mm. W późniejszych modyfikacjach genetycznych mających na celu stworzenie drożdży piwowarskich o właściwościach amylolitycznych, „fenolowy off-flavour” przeniesiony do hybrydy z S. diastaticus okazał się poważnym problemem. Jego przyczyną była dekarboksylacja pochodnych kwasu cynamomowego, np. dekarboksylacja kwasu ferulowego do 4-winylogwajakolu (4VG), jednak w odniesieniu do smaków pochodzących z torfowanego słodu, 4VG i podobne nuty fenolowe są pożądaną cechą hybrydy gorzelnianej. Z pośród cukrów pochodzących z hydrolizy skrobi, drożdże piwowarskie fermentują tylko glukozę, maltozę oraz maltotriozę. W praktyce wkład S. diastaticus w zdolności fermentacyjne hybrydy ogranicza się do fermentacji maltotetrozy i kilku innych niefermentowalnych di- i trisacharydów pochodzących ze skrobi. Choć jest teoretycznie możliwe stworzenie całkowicie amylolitycznych drożdży, naruszałoby to Scotch Whisky Regulations, które stanowią, że skrobia musi być hydrolizowana przez enzymy pochodzące ze słodu. Zasadnicze cechy drożdży gorzelnianych to:
Dobra produkcja aromatów
Całkowita i szybka fermentacja cukrów brzeczki
Odporność na ciśnienie osmotyczne początkowego stężenia cukru w brzeczce, w nowoczesnej praktyce co najmniej 16% i ewentualnie 20%
Zdolność do fermentacji do 8-10% etanolu w brzeczce.
Brak flokulacji i minimalne pienienie
Zdolność do wzrostu znacznie powyżej 30°C.
Korhola i in. (1989) opisali o drożdże gorzelniane zdolne do fermentacji w 46°C. Cecha ta zmniejsza zapotrzebowanie na energię do podgrzewania zacieru do destylacji. Takie szczepy nie są jednak stosowane w produkcji szkockiej whisky, gdzie maksymalna temperatura wzrostu wynosi około 35°C.
Biochemia drożdży
Najbardziej oczywistym efektem fermentacji jest powstawanie etanolu i dwutlenku węgla, ze stężeniem powstałego alkoholu sięgającym około połowy początkowego stężenia fermentowalnego cukru. Jednakże biologiczną funkcją fermentacji jest dostarczenie energii dla wzrostu drożdży, a zatem nieuchronnie część fermentowalnego cukru jest przekształcana na masę drożdży, a nie na pożądany z komercyjnego punktu widzenia etanol. Głównym problemem gorzelnika jest utrzymanie jakości alkoholu, ale ważnym czynnikiem ekonomicznym jest akceptowalnie wysoki uzysk alkoholu z surowców - a wydajność alkoholu spada wraz ze wzrostem drożdży.
Różne związki organiczne mogą być metabolizowane przez S. cerevisiae w warunkach tlenowych, ale dla fermentacji beztlenowej glukoza lub inny fermentowalny cukier jest podstawowym źródłem zarówno energii, jak i organicznego węgla do budowy nowego materiału komórkowego. Chociaż prawie wszystkie drożdże są zdolne do wzrostu na solach amonowych jako jedynym źródle azotu do syntezy białek (głównie enzymów) i kwasów nukleinowych, w fermentacjach gorzelnianych źródłem azotu są aminokwasy i proste peptydy z brzeczki.
Aby mógł nastąpić wzrost drożdży oraz fermentacja, drożdże wymagają odpowiedniego pH, temperatury i składników odżywczych. Jako grzyby, S. cerevisiae preferują kwaśne pH. Optymalne pH wynosi około 5,0-5,2, ale drożdże gorzelnicze są zdolne do prawidłowego wzrostu w zakresie pH 3,5-6,0. Dla drożdży gorzelniczych stosowanych w Szkocji optymalna temperatura (w sensie najszybszego wzrostu, a zatem najbardziej wydajnej fermentacji) to około 30-33°C. Chociaż drożdże gorzelnicze są zdolne do wzrostu w zakresie 5-35°C, tempo wzrostu w temperaturach poniżej około 25°C jest zbyt wolne dla fermentacji whisky.
Drożdże potrzebują także różnych soli mineralnych, zwłaszcza fosforanów i siarczanów, a wiele jonów metali jest wymaganych w śladowych ilościach jako kofaktory enzymów – najważniejsze z nich to żelazo, potas, mangan i cynk. Zwykle zawartość potrzebnych jonów w brzeczce lub zacierze jest wystarczająca, ale każdy niedobór spowoduje powolną fermentację, ponieważ nie można dodawać pożywek witaminowych ani mineralnych jak w browarze. Biotyna jest jedynym organicznym czynnikiem wzrostu (równoważnym terminowi witamina w żywieniu człowieka), który z pewnością jest wymagany przez drożdże, ale jest obecna w odpowiednim stężeniu w brzeczce destylarni słodowych i zbożowych. Poza tym, większość szczepów S. cerevisiae jest w stanie samemu zsyntetyzować witaminy, których ludzie potrzebują w swojej diecie: pantotenian, ryboflawinę, tiaminę itp. Jednak w warunkach fermentacji beztlenowej drożdże browarnicze i gorzelniane nie są w stanie syntetyzować nienasyconych kwasów tłuszczowych i steroli, które są niezbędnymi składnikami strukturalnymi błon komórkowych. Ponieważ ilości naturalnie obecne w brzeczce są niewystarczające dla wzrostu w warunkach beztlenowych, napowietrzanie brzeczki podczas dodawania drożdży pozwala inokulum drożdżowemu syntetyzować zapas tych związków w warunkach tlenowych.
Kongenery smakowe są produkowane jako produkty uboczne fermentacji cukrów do alkoholu. Chociaż tylko główne rodzaje kongenerów pokazano w tabeli 4.1, wykryto około 400 metabolitów smakowych wytworzonych podczas fermentacji alkoholowej przez drożdże i przyczyniających się do smaku piw, cydrów, win i destylowanych alkoholi. Związki te różnią się pod względem ich znaczenia dla jakości końcowego produktu. Dla dowolnego napoju alkoholowego rzeczywista ilość każdego związku jest mniej ważna niż jego próg zapachu - stężenie wykrywalne przez wyszkolony zespół sensoryczny. Lotność jest jednak również ważna w przypadku destylowanych napojów, a lotność substancji smakowych wpływa na ilość frakcji serca.
tabela 4.1
Fermentowalność brzeczki
Część analizy słodu, jaką jest ocena fermentowalności i tym samym prognozowanie wydajności produkcji alkoholu są również istotne dla etapu fermentacji. Standardowy ekstrakt gorącej wody (metoda 2.15 Baker, 1991) jest wykorzystywany jako brzeczka doświadczalna, która nie jest gotowana w celu zachowania aktywności enzymów słodu podczas fermentacji testowej przy użyciu szczepu M drożdży gorzelnianych. Jest to szczep wprowadzony do szkockich gorzelni whisky w 1952 roku, ale ponieważ późniejsze ulepszone szczepy nadal były nazywane M, stąd jego właściwości nie były stałe przez ostatnie 50 lat. Standardowa metoda określa zastosowanie komercyjnych drożdży M, ale ponieważ niekoniecznie jest to czysta kultura, istnieje pewna korzyść w zastosowaniu gwarantowanej czystej hodowli uzyskanej przez wysiewanie handlowych drożdży M w celu uzyskania pojedynczych kolonii.
Na podstawie zmierzonego spadku gęstości w czasie 44 godzin inkubacji w 33°C można obliczyć procent fermentowalnego ekstraktu. Na tej podstawie można oszacować wydajność alkoholu na tonę słodu - istotny aspekt analizy słodu i zbóż, ale liczba w dużej mierze zależy od wydajności hydrolizy skrobi podczas zacierania i fermentacji.
Budowa drożdży
Najbardziej zewnętrzną warstwą komórki drożdży jest sztywna ściana włóknistych b(1-3) i (1-6)-glukanów z zewnętrzną, bardziej amorficzną warstwą mannanu, głównie a(1-4), ale z łańcuchami bocznymi a(1-2) i a(1-3). Ponieważ blizny pozostawione przez oddzielanie kolejnych pączków składają się z chityny, polimeru N-acetyloglukozaminy, udział chityny rośnie w ściankach starszych komórek. Ściana komórkowa stanowi 15-25% suchej masy komórki i ma wiele funkcji: ochrona fizyczna, stabilność osmotyczna, wsparcie dla enzymów związanych z ścianą (np. inwertaza), adhezja międzykomórkowa (np. flokulacja) i jako bariera o selektywnej przepuszczalności. Chociaż wygodnie jest traktować ścianę jako przepuszczalną dla składników odżywczych i metabolitów, większe cząsteczki polisacharydów i polipeptydów są blokowane przez wielkość porów ściany.
To błona komórkowa (błona cytoplazmatyczna), zapobiega wyciekaniu rozpuszczalnych składników cytoplazmy do otoczenia, ale jest równie skuteczna w przeciwnym kierunku i zapobiega swobodnej dyfuzji składników odżywczych do komórki. Prawdziwa dyfuzja przez błonę, z szybkością określoną przez wielkość cząsteczki, rozpuszczalność w lipidach błony komórkowej i różnicę stężeń między otoczeniem a cytoplazmą, jest ograniczona do kilku prostych związków, takich jak etanol i dwutlenek węgla. Wszystkie inne związki wymagają „pomocy” specyficznych błonowych białek transportowych - permeaz do importu składników odżywczych i eksportu metabolitów. Cząsteczki mogą być transportowane na drodze ułatwionej dyfuzji, w której energia jest zapewniona przez różnicę stężeń w membranie lub przez transport aktywny, oprócz specyficznego układu transportowego wymagający wkładu energii przez komórkę.
Gatunki Saccharomyces rozmnażają się przez pączkowanie. Na ryc. 4.1 pokazano tylko jedną bliznę po pączkowaniu: jeśli jest to jedyna blizna na komórce, przedstawia ona "bliznę porodową" pozostawioną po odłączeniu się od komórki macierzystej. Jeśli tak, pierwszy pączek wyprodukowany przez nową komórkę drożdży znajdzie się na drugim końcu - niekoniecznie dokładnie naprzeciwko blizny po urodzeniu, ale prawdopodobnie w pobliżu punktu, w którym jądro komórkowe znajduje się najbliżej ściany komórkowej, w celu kontrolowania inicjacji pączków. Pierwszym etapem jest miejscowe zmiękczenie (przez precyzyjnie skierowaną b(1-6)-glukanazę) glukanu, który nadaje ściance komórkowej swoją sztywność. Ciśnienie osmotyczne w komórce powoduje puchnięcie - pierwsze widzialne pod mikroskopem etapu rozwoju pączka. Następnie synteza nowej ściany komórkowej, błony oraz materiału jądrowego i cytoplazmatycznego jest precyzyjnie programowana w czasie powstawania komórki, a w pełni uformowana komórka potomna odrywa się od matki, aby obie mogły niezależnie rozpocząć swój kolejny cykl komórkowy. Proces ten został zilustrowany przez Matile i wsp. (1969) w doskonałej serii rysunków z mikroskopów elektronowych. Mimo że niektóre fragmenty tekstu zostały bardziej rozwinięte przez nowsze badania, rysunki są nadal całkowicie poprawne, jako zobrazowanie cyklu komórkowego drożdży.
ryc. 4.1
W cytoplazmie znajdują się różne organella komórkowe. Najważniejsze z nich pokazano na ryc 4.1: jądro, mitochondria i wakuole. Są one również zamknięte w błonach o tej samej strukturze i funkcjach jak błona cytoplazmatyczna. W fazie spoczynkowej przedstawionej na rysunku 4.1 wakuola występuje jako pojedyncze organellum, największe w komórce, ale podczas cyklu tworzenia nowej komórki wakuola dzieli się na mniejsze i niektóre z nich migrują do rozwijającego się pączka przed wejściem do niego podzielonego jądra. Oczywiście istotne jest, aby jądrowy materiał genetyczny był replikowany dokładnie podczas podziału komórki, ale równie ważne jest, aby jednostki podzielonych mitochondriów i wakuoli dostały się do rozwijającego się pączka na odpowiednim etapie podziału komórki. Wśród biochemicznych funkcji wakuoli jest recykling białek i magazynowanie glikogenu jako zapasu energii, ale wydaje się również, że ma ona mechaniczną funkcję wymuszania przeniesienia części replikowanego jądra do rozwijającego się pączka.
Mitochondria są organellami niezbędnymi do tlenowego wzrostu drożdży i są dobrze rozwinięte w rosnących w warunkach tlenowych drożdży piekarniczych i gorzelniczych (ryc. 4.1). Pośród innych aktywności, organella te związane są z układami enzymatycznymi metabolizmu oksydacyjnego. Znaczenie mitochondriów w fermentacji jest omówione poniżej, w metabolizmie tlenu, ale Rose i Harrison (1991) dostarczają bardziej ogólnych informacji biologicznych na temat tych i innych organelli komórki drożdży.
Metabolizm węglowodanów
Istnieją trzy ważne aspekty metabolizmu węglowodanów podczas fermentacji:
1.Pobieranie fermentujących cukrów z brzeczki
2.Wytwarzanie etanolu i kongenerów smakowych w komórkach drożdży
3.Wydalanie metabolitów nadających smak brzeczce i ostatecznie whisky.
Tabela 4.2 pokazuje skład brzeczki ze słodu, ale od lat 60. XX wieku zdano sobie sprawę, że te cukry nie są wykorzystywane jednocześnie. Chociaż maltoza jest obecna w największej ilości, to nie jest początkowo wykorzystywana przez drożdże. Specyficzna permeaza dla glukozy jest enzymem konstytutywnym, który jest natychmiast dostępny podczas zaszczepiania brzeczki drożdżami, podczas gdy system transportu maltozy jest indukowalny.
tab. 4.2
Indukowalne enzymy syntetyzowane są tylko w obecności ich substratu, ale dodatkowo synteza permeazy maltozy nie jest aktywowana, dopóki stężenie glukozy nie spadnie poniżej stężenia progowego. Podobnie, transport maltotriozy nie jest indukowany, dopóki stężenie maltozy w brzeczce nie spadnie wystarczająco. W związku z tym pobieranie fermentowalnych cukrów zwykle przebiega tak, jak pokazano na ryc. 4.2.
Sposób działania układu transportowego również zależy od różnych cukrów. Wychwyt głównych węglowodanowych składników odżywczych typowej brzeczki słodowej przedstawiono na ryc. 4.3. Glukoza i fruktoza są transportowane w stanie nienaruszonym przez błonę komórkową (pokazaną na tym schemacie poprawnie jako dwuwarstwa lipidowa) poprzez ułatwioną dyfuzję z ich odpowiednią permeazą, znajdującą się w błonie. Przed dotarciem do błony komórkowej, sacharoza jest hydrolizowana w ścianie komórkowej przez system inwertazy związanej ze ścianą, a powstająca glukoza i fruktoza są transportowane do komórki. Maltoza i maltotrioza przedostają się do komórki przez wymagające nakładu energii układy transportu aktywnego, które fosforylują te cukry. Szczegółowe wyjaśnienie współczesnych koncepcji struktury i sposobu działania enzymów permeazy w drożdżach opisuje Slaughter (2002).
ryc. 4.2
ryc. 4.3
W warunkach tlenowych cukier jest całkowicie utleniany do dwutlenku węgla i wody, uwalniając taką samą ilość energii, jaką uzyskuje się dzięki chemicznemu spalaniu glukozy, ale w systemie biologicznym energia jest uwalniana i magazynowana jako związki wysokoenergetyczne. Podstawowym zapasem energii jest wysokoenergetyczne wiązanie grupy fosforanowej z adenozynodifosforanem tworzące adenozynotrifosforan, choć inne wiązania też są możliwe. W warunkach beztlenowych możliwe jest jedynie częściowe utlenianie prowadzące do kwasu pirogronowego. Szczegóły dotyczące fermentacyjnego metabolizmu heksoz są dostępne we wszystkich podręcznikach biochemii, a jedynie podstawowy zarys szlaku metabolicznego zaproponowanego przez Embden-Meyerhof-Parnas pokazano na ryc. 4.4.
Dla uproszczenia nazwy kilku enzymów podano uczestniczących w szlaku przemian podano na ryc. 4.4. Pierwsze etapy obejmują fosforylację cukru, proces wymagający energii – dwóch cząsteczek ATP na jedną cząsteczkę heksozy. Maltoza jest jednak fosforylowana już podczas transportu i przed hydrolizą do glukozy, więc pierwszy etap fosforylacji jest niepotrzebny. Ponadto, niezależnie od oryginalnej struktury heksozy, musi być ona zizomeryzowana do fruktozo-6-fosforanu. Tylko przy specyficznej strukturze 1,6-difosforan fruktozy z następnego etapu może zostać podzielony na dwie identyczne cząsteczki triozofosforanu (gliceraldehydo-3-fosforan).
Fosforylacja niekoniecznie wymaga energii pochodzącej z ATP; później w szlaku fosforylacja fosforanem nieorganicznym zachodzi przy redukcji dinukleotydu nikotynoaminoadeninowego (NAD) do NADH2. (Alternatywną nazwą NAD, stosowaną w niektórych podręcznikach i materiałach badawczych, jest nukleotyd dwufosfopirydyny, DPN.) Na ryc. 4.4 reakcja jest pokazana bardziej poprawnie jako NAD+ redukowany do NADH, przy fosforylacji gliceraldehydo-3-fosforanu do 1,3-difosfoglicerynianu . Kolejne reakcje obejmują przeniesienie fosforanu do ADP i izomeryzację w celu wytworzenia triozofosforanu w celu uwolnienia jego fosforanu, generując w sumie cztery cząsteczki ATP dla każdej cząsteczki heksozy. Ponieważ dwie są zobowiązane do "spłacenia" początkowego wykorzystania dwóch cząsteczek ATP, ogólny efekt tej drogi to zysk netto energii dwóch cząsteczek ATP, który jest wystarczający dla biosyntetycznych potrzeb rosnącej komórki.
ryc. 4.4
W drożdżach fermentacyjnych wymagana jest dalsza re-oksydacja NADH do NAD+ przez aldehyd octowy, aby umożliwić ciągłość metabolizmu przy ograniczonej ilości NAD w komórce. Dwa atomy wodoru usunięte w re-oksydacji każdej cząsteczki NAD redukują aldehyd octowy do etanolu. Dekarboksylacja pirogronianu oraz tworzenie aldehydu octowego i etanolu jest tylko jedną z wielu możliwych metod odzyskiwania NAD+: dla przykładu u wielu bakterii kwasu mlekowego ponowną re-oksydację NADH zapewnia pojedynczy etap redukcji pirogronianu do kwasu mlekowego.
Boczny szlak prowadzący do glicerolu zwykle stanowi jedynie niewielką część metabolizmu węglowodanów. Pyke (1965) odnotował 0,25% wag./obj. w zacierze zbożowym, znacznie powyżej poziomów wyższych alkoholi i estrów, ale lotność gliceolu jest zbyt niska, aby pojawił się on w destylacie. Kongenerami smakowymi wytwarzanymi bezpośrednio przez główną drogę szlaku EMP są kwas pirogronowy i aldehyd octowy, ale wiele innych kwasów, alkoholi i estrów wytwarzanych jest jako produktu uboczne biosyntetycznej aktywności drożdży (tabela 4.1). Jednak większość tych kongenerów smakowych to produkty uboczne biosyntezy lipidów, kwasów nukleinowych i białek, co pokazane zostanie w dalszej części tego rozdziału.
EMP jest tylko jedną z możliwych ścieżek dostarczającego energii metabolizmu węglowodanów, ale jest ważnym szlakiem przemian w beztlenowych warunkach fermentacji. Hough i in. (1982) dostarczyli adekwatnego opisu szlaku monofosforanu heksozy (lub monofosforanu pentozy), cyklu Krebsa i innych aktywności metabolicznych istotnych dla aerobowego wzrostu drożdży piwowarskich (a zatem także aerobowego rozmnażania drożdży gorzelnianych), ale bardziej szczegółowe wyjaśnienia można znaleźć w dowolnym podręczniku biochemii.
Metabolizm azotu
Aminokwasy wymagane do wzrostu drożdży powstają w wyniku hydrolizy białek słodu podczas słodowania, a ilość azotu a-aminokwasowego w brzeczce jest częściowo związana ze stopniem modyfikacji słodu. Im wyższa zawartość azotu a-aminokwasowego w brzeczce, tym większy wzrost drożdży (ostatecznie powyżej około 150-180 mg/l), co zmniejsza wydajność alkoholu przez większe zużycie cukru do budowy masy komórek drożdży zamiast etanolu. Wyższe poziomy azotu oznaczają również proporcjonalnie niższą zawartość węglowodanów w jęczmieniu i słodzie. Biorąc pod uwagę stosunkowo niską zawartość azotu w kukurydzy i pszenicy, jest mało prawdopodobne, aby stanowiło to problem w gorzelniach zbożowych, a wyższa zawartość azotu w jęczmieniu jest zwykle związana z wyższą aktywnością enzymów - ważną dla gorzelni zbożowej własnością słodu.
Niemożliwe jest, aby ograniczona przestrzeń błony komórkowej drożdży zawierała indywidualne enzymy permeazy dla każdego z dwudziestu aminokwasów budujących białka. Tylko kilka aminokwasów ma określone enzymy transportowe, a większość z nich musi się dzielić. Chociaż kilka aminokwasów budujących białka nie zostało wymienionych przez Jonesa i Pierce'a (1964) ani Pierce'a (1987), to w tabeli 4.3 pokazano porównanie szybkości wychwytu poszczególnych aminokwasów - w rzeczywistości podsumowanie ich systemów transportowych. Tylko kwas asparaginowy/asparagina, kwas glutaminowy/glutamina i lizyna mają swoje własne specyficzne enzymy transportowe. Ponieważ arginina, seryna i treonina mają wspólną pojedynczą permeazę, szybkość i ilość wychwytu każdego pojedynczego aminokwasu jest w przybliżeniu proporcjonalna do ich względnych ilości w brzeczce, ale wszystkie są absorbowane z brzeczki z wystarczająco dużą szybkością, aby spełnić wymagania rosnącej komórki dla tych aminokwasów. Prolina i hydroksyprolina są wchłaniane tylko powoli, ale spełniają wymagania komórki w trakcie fermentacji. Jednakże, ponieważ wszystkie aminokwasy wymienione jako "grupa B" mają wspólną pojedynczą permeazę, nie są one absorbowane w wystarczającej ilości, aby spełnić wymagania syntezy białka podczas aktywnego wzrostu drożdży. Wszystkie aminokwasy mogą być transportowane przez ogólną permeazę aminokwasową (GAP), ale jest ona nieaktywna, gdy działa specyficzny transport aminokwasów grupy A i B. Zatem aminokwasy wymienione jako grupa C, których transport jest całkowicie zależny od GAP, mogą być absorbowane dopiero późno w fermentacji, zbyt późno aby mogły być włączone bezpośrednio do struktury enzymu podczas fazy aktywnego wzrostu. Aby rozwinąć nowy pączek, rosnąca komórka drożdżowa musi zsyntetyzować swój własny materiał komórkowy z substancji odżywczych w brzeczce. Do tej aktywności biosyntetycznej wymagane są wszystkie aminokwasy z grupy C oraz niezbędny dodatek ograniczonego wychwytu z grupy B. Ponieważ lizyna nie może być wykorzystana w tym celu przez gatunek Saccharomyces, grupy aminowe kwasu asparaginowego/asparaginy i kwasu glutaminowego/glutaminy dostarczają azotu aminowego do biosyntezy innych aminokwasów.
tab. 4.3
ryc. 4.5
Ryc. 4.5 pokazuje proste podsumowanie powstawania różnych pośrednich ketokwasów wymaganych do syntezy aminokwasów. Chociaż reakcje enzymatyczne są zwykle odwracalne, niektóre etapy biosyntezy ketokwasów nie są. Jeśli podaż azotu aminowego zostanie wyczerpana, oczywiście ketokwasy nie mogą zostać przekształcone w zamierzone aminokwasy. Jednak ketokwasy stanowią cenny surowiec, którego nie można akumulować w warunkach beztlenowych. Stąd jeśli nie można ich przekształcić w aminokwasy, ketokwasy są dekarboksylowane do odpowiedniego aldehydu i redukowane do alkoholu przez reakcje analogiczne do metabolizmu pirogronianu do etanolu. Ogólna dehydrogenaza alkoholowa redukuje aldehyd do odpowiedniego alkoholu, chociaż dla każdego ketokwasu wymagana jest specyficzna dekarboksylaza. Dlatego, jeśli ubytek azotu uniemożliwia przekształcenie kwasu a-keto-izokapronowego w leucynę, powstaje zamiast niego alkohol izoamylowy (ryc. 4.6). Ta zależność między aminokwasami i wyższymi alkoholami została po raz pierwszy zauważona przez Ehrlicha w 1911 roku, ale reakcje nie zostały w pełni wyjaśnione aż do lat 50 XX wieku. Możliwe jest również, że nawet pomimo dostępności azotu aminowego drożdże mogą przekształcić część swojej rezerwy ketokwasów w wyższe alkohole, aby wytworzyć utleniony NAD. Ta odpowiedź na problem utleniania-redukcji jest analogiczna do reakcji powstawania glicerolu ścieżką Embden-Meyerhof-Parnas, gdzie szlak pirogronianu jest dokładnie zrównoważony w NAD i generuje zysk ATP a szlak glicerolu jest zrównoważony pod względem ATP i zapewnia zysk utleniononego NAD do wykorzystania w reakcjach biosyntetycznych w warunkach beztlenowych.
ryc. 4.6
Diacetyl jest kolejnym produktem ubocznym metabolizmu azotu. Ryc. 4.7 pokazuje, że izobutanol jest alkoholem wyższym związanym z biosyntezą waliny, ale acetylomleczan, związek pośredni w szlaku biosyntezy, jest dekarboksylowany i redukowany do acetoiny i 2,3-butanodiolu przez reakcje podobne do tworzenie etanolu. Jednakże, ślady tych trzech związków wydalane do zacieru mogą zostać utlenione w nieenzymatycznych reakcjach chemicznych do diacetylu, na przykład za pomocą tlenu atmosferycznego rozpuszczonego przez turbulencję podczas napełniania kotła, lub przez napowietrzenie zacieru przy destylacji ciągłej. Ponieważ reakcje chemiczne są przyspieszane przez wyższą temperaturę, konwersja do diacetylu przebiega szybko we wczesnych etapach destylacji. Przy swoim niskim progu aromatu (około 1 ppm) i podobnej lotności do etanolu, diacetyl jest najważniejszym kongenerem pokazanym na ryc. 4.7 i jest jednym z niewielu związków, których nie można całkowicie usunąć z neutralnego spirytusu.
ryc. 4.7
Powstawanie kwasów tłuszczowych i estrów
Estry reprezentują inną grupę kongenerów smakowych powstających podczas fermentacji. Chociaż nieenzymatyczna estryfikacja kwasów i alkoholi jest ważną częścią rozwoju smaku podczas dojrzewania whisky, reakcja ta jest zbyt wolna, aby odpowiadać za estry wytworzone podczas fermentacji. Wytwarzanie estrów jest związane z odtwarzaniem kofaktora enzymu, koenzymu A (CoA). Kwas octowy i długołańcuchowe kwasy tłuszczowe są ważnymi produktami pośrednimi w biosyntezie, ale część tych związków jest tracona przez odpływ do zacieru, gdzie pojawiają się jako kongenery smakowe (tabela 4.1). AcetyloCoA i jego wyższe homologi, wspólnie określane jako R-CO~SCoA na ryc. 4.8, są ważnymi produktami pośrednimi w biosyntezie białek enzymatycznych, kwasów nukleinowych i lipidów. Warto zauważyć nietypowe usunięcie dwóch grup fosforanowych z ATP (z wytworzeniem adenozynomonofosforanu) [na ryc.4.8 jest literówka, zamiast „ATP – > ATP + (PP)” winno być „ATP – > AMP + (PP)” - przyp. tłum.] w przenoszeniu wysokoenergetycznego wiązania z ATP do kompleksu CoA. Jeśli jednak acetylo- lub acylo-CoA nie jest potrzebny, CoA musi być odtworzony dla odzyskania energii reprezentowanej przez wiązanie ~ i dla utrzymania ograniczonego wewnątrzkomórkowego zasobu samego CoA. Po usunięciu CoA grupa kwasowa jest stabilizowana przez estryfikację przy udziale enzymu esterazy (esterazy katalizują reakcję w obu kierunkach).
ryc. 4.8
Ponieważ kwas octowy i etanol to kwas i alkohol powstające w największych ilościach podczas fermentacji, naturalnie octan etylu jest głównym estrem pod względem ilości, chociaż inne estry z niższym progiem aromatu mają większy wpływ na zacier, alkohol i końcową whisky. Szersze implikacje odtwarzania CoA przedstawiono na ryc. 4.9, który wskazuje źródła etanolu, wyższych alkoholi i różnych grup kwasowych zaangażowanych w produkcję estrów.
ryc. 4.9
Metabolizm siarki
Podobnie jak w piwowarstwie i winiarstwie, również w gorzelnictwie w powstawaniu związków siarki szczególne znaczenie mają dwa typy reakcji: biosynteza aminokwasów siarkowych (ryc. 4.10) oraz redukcja siarczanów z brzeczki. Destylacja różni się od innych procesów korzystnym działaniem miedzi z której zbudowane są aparaty destylacyjne, ale przy normalnym stosunku powierzchni miedzi do pojemności kotła, niemożliwe jest (i niepożądane) całkowite usunięcie związków siarki.
ryc. 4.10
Biosynteza cysteiny i metioniny powoduje analogiczne problemy związane ze smakiem jak biosynteza innych aminokwasów, ale w tym przypadku problemy są bardziej poważne z powodu niższego progu aromatu wielu zawierających siarkę produktów ubocznych. Innym źródłem siarkowych off-flavours jest redukcja SO42- do S2- w trakcie fermentacji. Znaczna część powstającego siarkowodoru jest usuwana w wyniku wydzielania się dwutlenku węgla podczas fermentacji, a zatem stanowi głównie problem w gromadzeniu dwutlenku węgla spożywczego, ale wystarczająca ilość siarkowodoru i organicznych związków siarki może pozostać w zacierze, aby wpłynąć na jakość destylowanego alkoholu.
Metabolizm tlenu
Odkrycie przejścia między fermentacją a oddychaniem poprzez cofnięcie lub przywrócenie dopływu powietrza przypisywane jest Ludwikowi Pasteurowi chociaż istnieją teraz pewne wątpliwości, czy to faktycznie było jego odkrycie. Jest jednak z pewnością prawdą, że fakultatywnie beztlenowe bakterie szybko dostosowują się z metabolizmu oksydacyjnego do fermentacyjnego w zależności od obecności lub braku tlenu atmosferycznego. Sytuacja z drożdżami jest bardziej złożona.
Po pierwsze, drożdże z gatunku Saccharomyces i inne drożdże fermentacyjne nie mogą rosnąć w nieskończoność w warunkach beztlenowych bez pewnych składników odżywczych, które są im niepotrzebne w warunkach tlenowych. Sterole i nienasycone kwasy tłuszczowe, podstawowe składniki błon komórkowych drożdży (a także wszystkich organizmów eukariotycznych), nie mogą być syntetyzowane beztlenowo, co ogranicza beztlenowy wzrost drożdży do dwóch lub trzech pokoleń, o ile te związki nie występują w pożywce hodowlanej (brzeczce). Po drugie, drożdże fermentacyjne nie są prawdziwymi fakultatywnymi beztlenowcami, ponieważ pierwszeństwo ma efekt Crabtree. Powyżej około 1% fermentowalnego cukru w pożywce hodowlanej (dokładny procent różni się pomiędzy szczepami) drożdże fermentują przez metabolizm beztlenowy bez względu na to, jak dobrze napowietrzono pożywkę hodowlaną. Zamiast tego, rozpuszczony tlen jest wykorzystywany do biosyntezy błonowych kwasów tłuszczowych i steroli, umożliwiając w ten sposób bardziej obfity ilościowo wzrost gdy warunki tlenowe nie są już dostępne. Dlatego, mimo że celowe dodawanie nienasyconych kwasów tłuszczowych i steroli do brzeczki w celu zachęcenia drożdży do wzrostu jest niedozwolone w fermentacji szkockiej whisky, ten sam efekt można uzyskać legalnie przez napowietrzenie brzeczki.
W artykule opisującym częściowo własne doświadczenia, ale także obszernie przeglądającym literaturę dotyczącą efektów Pasteura i Crabtree, O'Connor-Cox i wsp. (1996) stwierdzili, że z rozpuszczonego tlenu obecnego w brzeczce na początku fermentacji browarniczej, tylko około 30% zostało użyte bezpośrednio do syntezy nienasyconych kwasów tłuszczowych i steroli. Stwierdzono, że tlen rozpuszczony w brzeczce nie jest wykorzystywany do tlenowego metabolizmu cukrów. W rzeczywistości reszta rozpuszczonego tlenu wykorzystywana jest do przywracania zdegenerowanych mitochondriów beztlenowych komórek drożdży do stanu w pełni funkcjonalnego wymaganego do syntezy lipidów, a być może także do syntezy innych niezbędnych czynników wzrostu. W ciągu kilku godzin zawartość rozpuszczonego tlenu w brzeczce spada do zera, a mitochondria powracają do stanu zdegenerowanego związanego z warunkami beztlenowymi. Jednakże, O'Connor-Cox i wsp. (1996) stwierdzili, że bez okresu pełnej funkcji mitochondrialnej nie może nastąpić późniejsza fermentacja. Ekstrapolując te obserwacje do szkockiej whisky, fermentacja z pewnością wymaga napowietrzania, ale czysta kultura hodowanych tlenowo drożdżowy, które już w pełni rozwinęły mitochondria, powinna w razie potrzeby być w stanie przeprowadzić zadowalającą fermentację bez napowietrzania. Mimo to jest prawdopodobne, że fermentacja przebiegałaby inaczej z napowietrzaniem i bez napowietrzania. [ciężko to przetłumaczyć słowo w słowo, w naszych warunkach chodzi o to, że napowietrzanie jest korzystne gdy tylko uwadniamy suche drożdże, natomiast starter z mieszadła powinien poradzić sobie nawet z brzeczką nie napowietrzoną – przyp. tłum.]
Podsumowanie produkcji aromatu podczas fermentacji
W browarach zmiana składu brzeczki ma istotny wpływ na profil smakowy piwa, ale ta opcja nie jest legalnie dostępna dla gorzelników szkockiej whisky. Inne zmienne fermentacji, o których wiadomo, że wpływają na smak piwa, są istotne dla fermentacji szkockiej whisky, chociaż możliwości celowego manipulowania smakiem są bardziej ograniczone. Na produkcję smakowych kongenerów wpływają następujące czynniki:
Właściwości genetyczne szczepu drożdży
Stan drożdży podczas dodawania do brzeczki (żywotność i witalność)
Ilość inokulum drożdżowego
Początkowe napowietrzanie brzeczki
Profil temperatury podczas fermentacji
Skażenie mikrobiologiczne.
tab. 4.4
Podsumowanie wpływu warunków fermentacji na wytwarzanie kongenerów smakowych przedstawiono w tabeli 4.4. Temperatura fermentacji ma istotny wpływ i była szeroko badana w kontekście fermentacji browarniczych w latach 60. i na początku lat 70. XX wieku. Generalną zasadą jest to, że wzrost temperatury fermentacji zwiększa stosunek ilości drożdży do dostępnego azotu a-aminokwasowego, co prowadzi do zwiększonej produkcji wyższych alkoholi. Zwiększony wzrost drożdży oznacza zmniejszenie odtwarzania CoA, co zmniejsza produkcję estrów.
Chociaż w odróżnieniu od browarów utrzymywanie stałej temperatury fermentacji nie jest typową praktyką gorzelniczą, stałe poziomy kongenerów smakowych w brzeczce wymagają spójnych profili temperaturowych podczas kolejnych fermentacji, co osiąga się przez ocenę prawidłowej temperatury początkowej brzeczki dla temperatury otoczenia.
Właściwości genetyczne drożdży wpływają również na produkcję kongenerów smakowych. Żadne dwa szczepy nie reagują identycznie na temperaturę fermentacji, zawartość rozpuszczonego tlenu i azotu aminowego (organicznego) w brzeczce. Dlatego też zmiana na inną kulturę może wpłynąć na smak brzeczki i ostatecznie na alkohol i whisky. Ponieważ aromat "estrowy" stał się pożądaną cechą, Hay i in. (1994) opracowali drożdże o wyższej wydajności poprzez manipulację genetyczną. Jednakże przy obecnym publicznym antagonizmie wobec organizmów zmanipulowanych genetycznie jest mało prawdopodobne, że takie drożdże będą wykorzystywane komercyjnie w niedalekiej przyszłości do generowania wyższych poziomów estrów w whisky, nawet jeśli są zgodne z przepisami whisky szkockiej.
Wstęp
W porównaniu z ilością literatury dotyczącej biochemii i mikrobiologii fermentacji piwa i wina lub popularnej literatury na temat samej whisky, niewiele jest naukowych informacji dotyczących fermentacji szkockiej whisky. Prace przeglądowe Berry'ego i Ramsay'a (1983) oraz Korhola i in. (1989) są jednymi z nielicznych dotyczących tego etapu produkcji whisky. Na szczęście przebieg fermentacji jest podobny w browarze i gorzelni, a dużą ilość informacji dla ogólnego zrozumienia procesu fermentacji można znaleźć w literaturze piwowarskiej (patrz, na przykład, Hough i wsp., 1982, Young, 1996, Boulton i Quain, 2001, Slaughter, 2002). Przeglądy te dostarczają już autorytatywnych wyjaśnień dotyczących fermentacji alkoholowej brzeczki na bazie zbóż, dlatego ten rozdział bardziej dotyczy praktycznych różnic między piwowarstwem a fermentacją w gorzelni i nie podejmuje żadnej próby omówienia destylowanych produktów innych niż szkocka whisky.
Zarówno w destylarniach whisky słodowej jak i zbożowej głównymi źródłami kongenerów w new-make'u są:
Słód i destylowane zboża
Lotne składniki strukturalne drożdży
Metabolity drożdży
Mikrobiologiczne zanieczyszczenia fermentacji.
Chociaż bardziej efektywna rektyfikacja ciągła zmniejsza wkład tych czterech czynników smakowych w porównaniu z wpływem późniejszego dojrzewania, to zarówno drożdże, jak i przebieg fermentacji są ważnymi czynnikami przyczyniającymi się do charakteru tych dwóch rodzajów szkockiej whisky. W rzeczywistości jest to zobowiązanie prawne: przepisy wymagają, aby whisky zachowała aromat i smak pochodzący z fermentacji drożdżowej zacieru ze słodu lub zacieranego słodem zacieru zbożowego.
Drożdże do fermentacji alkoholowej
Nazwa ogólna Saccharomyces (łac. grzyb cukrowy) została po raz pierwszy zastosowana przez Meyena w 1838 roku, ale nowoczesna taksonomia drożdży w przemyśle fermentacji alkoholowej wywodzi się w dużej mierze z pracy Hansena w Carlsberg Laboratories w Danii w latach 80. XIX wieku (Barnett i wsp., 1990). Hansen nadał różne nazwy drożdżom zbierającym się w trakcie fermentacji w górnej części fermentora (drożdże z piw brytyjskich, belgijskich oraz z północy Niemiec) - S. cerevisiae, drożdżom zbierającym się w trakcie fermentacji na dnie fermentora, pracującym w niższym zakresie temperatur fermentacji - S. carlsbergensis oraz posiadającym większą tolerancję na alkohol drożdżom winnym z charakterystycznymi elipsoidalnymi komórkami (S. ellipsoideus). Od tego czasu klasyfikacja była często zmieniana, a obecnie wszystkie trzy z tych dawnych gatunków zostały nazwane S. cerevisiae. Chociaż jest to uzasadnione zasadami taksonomii botanicznej (w tym dotyczącej grzybów), to uciążliwe jest, że drożdże o tak różnych właściwościach przemysłowych nie mają oficjalnych nazw, które pozwoliłyby je odróżnić. Fermentujące skrobię dzikie drożdże oraz zanieczyszczenia browarnicze początkowo wyizolowane jako S. diastaticus są teraz również zawarte w S. cerevisiae.
Początkowo piekarze i gorzelnicy whisky z powodzeniem przeprowadzali fermentację, wykorzystując nadmiar drożdży wytwarzanych przez przemysł piwowarski, ale wyhodowanie odmian o ulepszonych właściwościach dla branży piekarniczej pobudziło równoważny rozwój wyspecjalizowanych drożdży gorzelnianych. Oczywiście drożdże typu ale były ważnym składnikiem hybrydy, ale z powodu swych właściwości amylolitycznych zastosowano również S. diastaticus. W przeciwieństwie do prawie kulistych drożdży piwnych, hybrydy gorzelniane mają eliptyczny kształt o wymiarach o długości około 10 mm i średnicy 5 mm. W późniejszych modyfikacjach genetycznych mających na celu stworzenie drożdży piwowarskich o właściwościach amylolitycznych, „fenolowy off-flavour” przeniesiony do hybrydy z S. diastaticus okazał się poważnym problemem. Jego przyczyną była dekarboksylacja pochodnych kwasu cynamomowego, np. dekarboksylacja kwasu ferulowego do 4-winylogwajakolu (4VG), jednak w odniesieniu do smaków pochodzących z torfowanego słodu, 4VG i podobne nuty fenolowe są pożądaną cechą hybrydy gorzelnianej. Z pośród cukrów pochodzących z hydrolizy skrobi, drożdże piwowarskie fermentują tylko glukozę, maltozę oraz maltotriozę. W praktyce wkład S. diastaticus w zdolności fermentacyjne hybrydy ogranicza się do fermentacji maltotetrozy i kilku innych niefermentowalnych di- i trisacharydów pochodzących ze skrobi. Choć jest teoretycznie możliwe stworzenie całkowicie amylolitycznych drożdży, naruszałoby to Scotch Whisky Regulations, które stanowią, że skrobia musi być hydrolizowana przez enzymy pochodzące ze słodu. Zasadnicze cechy drożdży gorzelnianych to:
Dobra produkcja aromatów
Całkowita i szybka fermentacja cukrów brzeczki
Odporność na ciśnienie osmotyczne początkowego stężenia cukru w brzeczce, w nowoczesnej praktyce co najmniej 16% i ewentualnie 20%
Zdolność do fermentacji do 8-10% etanolu w brzeczce.
Brak flokulacji i minimalne pienienie
Zdolność do wzrostu znacznie powyżej 30°C.
Korhola i in. (1989) opisali o drożdże gorzelniane zdolne do fermentacji w 46°C. Cecha ta zmniejsza zapotrzebowanie na energię do podgrzewania zacieru do destylacji. Takie szczepy nie są jednak stosowane w produkcji szkockiej whisky, gdzie maksymalna temperatura wzrostu wynosi około 35°C.
Biochemia drożdży
Najbardziej oczywistym efektem fermentacji jest powstawanie etanolu i dwutlenku węgla, ze stężeniem powstałego alkoholu sięgającym około połowy początkowego stężenia fermentowalnego cukru. Jednakże biologiczną funkcją fermentacji jest dostarczenie energii dla wzrostu drożdży, a zatem nieuchronnie część fermentowalnego cukru jest przekształcana na masę drożdży, a nie na pożądany z komercyjnego punktu widzenia etanol. Głównym problemem gorzelnika jest utrzymanie jakości alkoholu, ale ważnym czynnikiem ekonomicznym jest akceptowalnie wysoki uzysk alkoholu z surowców - a wydajność alkoholu spada wraz ze wzrostem drożdży.
Różne związki organiczne mogą być metabolizowane przez S. cerevisiae w warunkach tlenowych, ale dla fermentacji beztlenowej glukoza lub inny fermentowalny cukier jest podstawowym źródłem zarówno energii, jak i organicznego węgla do budowy nowego materiału komórkowego. Chociaż prawie wszystkie drożdże są zdolne do wzrostu na solach amonowych jako jedynym źródle azotu do syntezy białek (głównie enzymów) i kwasów nukleinowych, w fermentacjach gorzelnianych źródłem azotu są aminokwasy i proste peptydy z brzeczki.
Aby mógł nastąpić wzrost drożdży oraz fermentacja, drożdże wymagają odpowiedniego pH, temperatury i składników odżywczych. Jako grzyby, S. cerevisiae preferują kwaśne pH. Optymalne pH wynosi około 5,0-5,2, ale drożdże gorzelnicze są zdolne do prawidłowego wzrostu w zakresie pH 3,5-6,0. Dla drożdży gorzelniczych stosowanych w Szkocji optymalna temperatura (w sensie najszybszego wzrostu, a zatem najbardziej wydajnej fermentacji) to około 30-33°C. Chociaż drożdże gorzelnicze są zdolne do wzrostu w zakresie 5-35°C, tempo wzrostu w temperaturach poniżej około 25°C jest zbyt wolne dla fermentacji whisky.
Drożdże potrzebują także różnych soli mineralnych, zwłaszcza fosforanów i siarczanów, a wiele jonów metali jest wymaganych w śladowych ilościach jako kofaktory enzymów – najważniejsze z nich to żelazo, potas, mangan i cynk. Zwykle zawartość potrzebnych jonów w brzeczce lub zacierze jest wystarczająca, ale każdy niedobór spowoduje powolną fermentację, ponieważ nie można dodawać pożywek witaminowych ani mineralnych jak w browarze. Biotyna jest jedynym organicznym czynnikiem wzrostu (równoważnym terminowi witamina w żywieniu człowieka), który z pewnością jest wymagany przez drożdże, ale jest obecna w odpowiednim stężeniu w brzeczce destylarni słodowych i zbożowych. Poza tym, większość szczepów S. cerevisiae jest w stanie samemu zsyntetyzować witaminy, których ludzie potrzebują w swojej diecie: pantotenian, ryboflawinę, tiaminę itp. Jednak w warunkach fermentacji beztlenowej drożdże browarnicze i gorzelniane nie są w stanie syntetyzować nienasyconych kwasów tłuszczowych i steroli, które są niezbędnymi składnikami strukturalnymi błon komórkowych. Ponieważ ilości naturalnie obecne w brzeczce są niewystarczające dla wzrostu w warunkach beztlenowych, napowietrzanie brzeczki podczas dodawania drożdży pozwala inokulum drożdżowemu syntetyzować zapas tych związków w warunkach tlenowych.
Kongenery smakowe są produkowane jako produkty uboczne fermentacji cukrów do alkoholu. Chociaż tylko główne rodzaje kongenerów pokazano w tabeli 4.1, wykryto około 400 metabolitów smakowych wytworzonych podczas fermentacji alkoholowej przez drożdże i przyczyniających się do smaku piw, cydrów, win i destylowanych alkoholi. Związki te różnią się pod względem ich znaczenia dla jakości końcowego produktu. Dla dowolnego napoju alkoholowego rzeczywista ilość każdego związku jest mniej ważna niż jego próg zapachu - stężenie wykrywalne przez wyszkolony zespół sensoryczny. Lotność jest jednak również ważna w przypadku destylowanych napojów, a lotność substancji smakowych wpływa na ilość frakcji serca.
tabela 4.1
Fermentowalność brzeczki
Część analizy słodu, jaką jest ocena fermentowalności i tym samym prognozowanie wydajności produkcji alkoholu są również istotne dla etapu fermentacji. Standardowy ekstrakt gorącej wody (metoda 2.15 Baker, 1991) jest wykorzystywany jako brzeczka doświadczalna, która nie jest gotowana w celu zachowania aktywności enzymów słodu podczas fermentacji testowej przy użyciu szczepu M drożdży gorzelnianych. Jest to szczep wprowadzony do szkockich gorzelni whisky w 1952 roku, ale ponieważ późniejsze ulepszone szczepy nadal były nazywane M, stąd jego właściwości nie były stałe przez ostatnie 50 lat. Standardowa metoda określa zastosowanie komercyjnych drożdży M, ale ponieważ niekoniecznie jest to czysta kultura, istnieje pewna korzyść w zastosowaniu gwarantowanej czystej hodowli uzyskanej przez wysiewanie handlowych drożdży M w celu uzyskania pojedynczych kolonii.
Na podstawie zmierzonego spadku gęstości w czasie 44 godzin inkubacji w 33°C można obliczyć procent fermentowalnego ekstraktu. Na tej podstawie można oszacować wydajność alkoholu na tonę słodu - istotny aspekt analizy słodu i zbóż, ale liczba w dużej mierze zależy od wydajności hydrolizy skrobi podczas zacierania i fermentacji.
Budowa drożdży
Najbardziej zewnętrzną warstwą komórki drożdży jest sztywna ściana włóknistych b(1-3) i (1-6)-glukanów z zewnętrzną, bardziej amorficzną warstwą mannanu, głównie a(1-4), ale z łańcuchami bocznymi a(1-2) i a(1-3). Ponieważ blizny pozostawione przez oddzielanie kolejnych pączków składają się z chityny, polimeru N-acetyloglukozaminy, udział chityny rośnie w ściankach starszych komórek. Ściana komórkowa stanowi 15-25% suchej masy komórki i ma wiele funkcji: ochrona fizyczna, stabilność osmotyczna, wsparcie dla enzymów związanych z ścianą (np. inwertaza), adhezja międzykomórkowa (np. flokulacja) i jako bariera o selektywnej przepuszczalności. Chociaż wygodnie jest traktować ścianę jako przepuszczalną dla składników odżywczych i metabolitów, większe cząsteczki polisacharydów i polipeptydów są blokowane przez wielkość porów ściany.
To błona komórkowa (błona cytoplazmatyczna), zapobiega wyciekaniu rozpuszczalnych składników cytoplazmy do otoczenia, ale jest równie skuteczna w przeciwnym kierunku i zapobiega swobodnej dyfuzji składników odżywczych do komórki. Prawdziwa dyfuzja przez błonę, z szybkością określoną przez wielkość cząsteczki, rozpuszczalność w lipidach błony komórkowej i różnicę stężeń między otoczeniem a cytoplazmą, jest ograniczona do kilku prostych związków, takich jak etanol i dwutlenek węgla. Wszystkie inne związki wymagają „pomocy” specyficznych błonowych białek transportowych - permeaz do importu składników odżywczych i eksportu metabolitów. Cząsteczki mogą być transportowane na drodze ułatwionej dyfuzji, w której energia jest zapewniona przez różnicę stężeń w membranie lub przez transport aktywny, oprócz specyficznego układu transportowego wymagający wkładu energii przez komórkę.
Gatunki Saccharomyces rozmnażają się przez pączkowanie. Na ryc. 4.1 pokazano tylko jedną bliznę po pączkowaniu: jeśli jest to jedyna blizna na komórce, przedstawia ona "bliznę porodową" pozostawioną po odłączeniu się od komórki macierzystej. Jeśli tak, pierwszy pączek wyprodukowany przez nową komórkę drożdży znajdzie się na drugim końcu - niekoniecznie dokładnie naprzeciwko blizny po urodzeniu, ale prawdopodobnie w pobliżu punktu, w którym jądro komórkowe znajduje się najbliżej ściany komórkowej, w celu kontrolowania inicjacji pączków. Pierwszym etapem jest miejscowe zmiękczenie (przez precyzyjnie skierowaną b(1-6)-glukanazę) glukanu, który nadaje ściance komórkowej swoją sztywność. Ciśnienie osmotyczne w komórce powoduje puchnięcie - pierwsze widzialne pod mikroskopem etapu rozwoju pączka. Następnie synteza nowej ściany komórkowej, błony oraz materiału jądrowego i cytoplazmatycznego jest precyzyjnie programowana w czasie powstawania komórki, a w pełni uformowana komórka potomna odrywa się od matki, aby obie mogły niezależnie rozpocząć swój kolejny cykl komórkowy. Proces ten został zilustrowany przez Matile i wsp. (1969) w doskonałej serii rysunków z mikroskopów elektronowych. Mimo że niektóre fragmenty tekstu zostały bardziej rozwinięte przez nowsze badania, rysunki są nadal całkowicie poprawne, jako zobrazowanie cyklu komórkowego drożdży.
ryc. 4.1
W cytoplazmie znajdują się różne organella komórkowe. Najważniejsze z nich pokazano na ryc 4.1: jądro, mitochondria i wakuole. Są one również zamknięte w błonach o tej samej strukturze i funkcjach jak błona cytoplazmatyczna. W fazie spoczynkowej przedstawionej na rysunku 4.1 wakuola występuje jako pojedyncze organellum, największe w komórce, ale podczas cyklu tworzenia nowej komórki wakuola dzieli się na mniejsze i niektóre z nich migrują do rozwijającego się pączka przed wejściem do niego podzielonego jądra. Oczywiście istotne jest, aby jądrowy materiał genetyczny był replikowany dokładnie podczas podziału komórki, ale równie ważne jest, aby jednostki podzielonych mitochondriów i wakuoli dostały się do rozwijającego się pączka na odpowiednim etapie podziału komórki. Wśród biochemicznych funkcji wakuoli jest recykling białek i magazynowanie glikogenu jako zapasu energii, ale wydaje się również, że ma ona mechaniczną funkcję wymuszania przeniesienia części replikowanego jądra do rozwijającego się pączka.
Mitochondria są organellami niezbędnymi do tlenowego wzrostu drożdży i są dobrze rozwinięte w rosnących w warunkach tlenowych drożdży piekarniczych i gorzelniczych (ryc. 4.1). Pośród innych aktywności, organella te związane są z układami enzymatycznymi metabolizmu oksydacyjnego. Znaczenie mitochondriów w fermentacji jest omówione poniżej, w metabolizmie tlenu, ale Rose i Harrison (1991) dostarczają bardziej ogólnych informacji biologicznych na temat tych i innych organelli komórki drożdży.
Metabolizm węglowodanów
Istnieją trzy ważne aspekty metabolizmu węglowodanów podczas fermentacji:
1.Pobieranie fermentujących cukrów z brzeczki
2.Wytwarzanie etanolu i kongenerów smakowych w komórkach drożdży
3.Wydalanie metabolitów nadających smak brzeczce i ostatecznie whisky.
Tabela 4.2 pokazuje skład brzeczki ze słodu, ale od lat 60. XX wieku zdano sobie sprawę, że te cukry nie są wykorzystywane jednocześnie. Chociaż maltoza jest obecna w największej ilości, to nie jest początkowo wykorzystywana przez drożdże. Specyficzna permeaza dla glukozy jest enzymem konstytutywnym, który jest natychmiast dostępny podczas zaszczepiania brzeczki drożdżami, podczas gdy system transportu maltozy jest indukowalny.
tab. 4.2
Indukowalne enzymy syntetyzowane są tylko w obecności ich substratu, ale dodatkowo synteza permeazy maltozy nie jest aktywowana, dopóki stężenie glukozy nie spadnie poniżej stężenia progowego. Podobnie, transport maltotriozy nie jest indukowany, dopóki stężenie maltozy w brzeczce nie spadnie wystarczająco. W związku z tym pobieranie fermentowalnych cukrów zwykle przebiega tak, jak pokazano na ryc. 4.2.
Sposób działania układu transportowego również zależy od różnych cukrów. Wychwyt głównych węglowodanowych składników odżywczych typowej brzeczki słodowej przedstawiono na ryc. 4.3. Glukoza i fruktoza są transportowane w stanie nienaruszonym przez błonę komórkową (pokazaną na tym schemacie poprawnie jako dwuwarstwa lipidowa) poprzez ułatwioną dyfuzję z ich odpowiednią permeazą, znajdującą się w błonie. Przed dotarciem do błony komórkowej, sacharoza jest hydrolizowana w ścianie komórkowej przez system inwertazy związanej ze ścianą, a powstająca glukoza i fruktoza są transportowane do komórki. Maltoza i maltotrioza przedostają się do komórki przez wymagające nakładu energii układy transportu aktywnego, które fosforylują te cukry. Szczegółowe wyjaśnienie współczesnych koncepcji struktury i sposobu działania enzymów permeazy w drożdżach opisuje Slaughter (2002).
ryc. 4.2
ryc. 4.3
W warunkach tlenowych cukier jest całkowicie utleniany do dwutlenku węgla i wody, uwalniając taką samą ilość energii, jaką uzyskuje się dzięki chemicznemu spalaniu glukozy, ale w systemie biologicznym energia jest uwalniana i magazynowana jako związki wysokoenergetyczne. Podstawowym zapasem energii jest wysokoenergetyczne wiązanie grupy fosforanowej z adenozynodifosforanem tworzące adenozynotrifosforan, choć inne wiązania też są możliwe. W warunkach beztlenowych możliwe jest jedynie częściowe utlenianie prowadzące do kwasu pirogronowego. Szczegóły dotyczące fermentacyjnego metabolizmu heksoz są dostępne we wszystkich podręcznikach biochemii, a jedynie podstawowy zarys szlaku metabolicznego zaproponowanego przez Embden-Meyerhof-Parnas pokazano na ryc. 4.4.
Dla uproszczenia nazwy kilku enzymów podano uczestniczących w szlaku przemian podano na ryc. 4.4. Pierwsze etapy obejmują fosforylację cukru, proces wymagający energii – dwóch cząsteczek ATP na jedną cząsteczkę heksozy. Maltoza jest jednak fosforylowana już podczas transportu i przed hydrolizą do glukozy, więc pierwszy etap fosforylacji jest niepotrzebny. Ponadto, niezależnie od oryginalnej struktury heksozy, musi być ona zizomeryzowana do fruktozo-6-fosforanu. Tylko przy specyficznej strukturze 1,6-difosforan fruktozy z następnego etapu może zostać podzielony na dwie identyczne cząsteczki triozofosforanu (gliceraldehydo-3-fosforan).
Fosforylacja niekoniecznie wymaga energii pochodzącej z ATP; później w szlaku fosforylacja fosforanem nieorganicznym zachodzi przy redukcji dinukleotydu nikotynoaminoadeninowego (NAD) do NADH2. (Alternatywną nazwą NAD, stosowaną w niektórych podręcznikach i materiałach badawczych, jest nukleotyd dwufosfopirydyny, DPN.) Na ryc. 4.4 reakcja jest pokazana bardziej poprawnie jako NAD+ redukowany do NADH, przy fosforylacji gliceraldehydo-3-fosforanu do 1,3-difosfoglicerynianu . Kolejne reakcje obejmują przeniesienie fosforanu do ADP i izomeryzację w celu wytworzenia triozofosforanu w celu uwolnienia jego fosforanu, generując w sumie cztery cząsteczki ATP dla każdej cząsteczki heksozy. Ponieważ dwie są zobowiązane do "spłacenia" początkowego wykorzystania dwóch cząsteczek ATP, ogólny efekt tej drogi to zysk netto energii dwóch cząsteczek ATP, który jest wystarczający dla biosyntetycznych potrzeb rosnącej komórki.
ryc. 4.4
W drożdżach fermentacyjnych wymagana jest dalsza re-oksydacja NADH do NAD+ przez aldehyd octowy, aby umożliwić ciągłość metabolizmu przy ograniczonej ilości NAD w komórce. Dwa atomy wodoru usunięte w re-oksydacji każdej cząsteczki NAD redukują aldehyd octowy do etanolu. Dekarboksylacja pirogronianu oraz tworzenie aldehydu octowego i etanolu jest tylko jedną z wielu możliwych metod odzyskiwania NAD+: dla przykładu u wielu bakterii kwasu mlekowego ponowną re-oksydację NADH zapewnia pojedynczy etap redukcji pirogronianu do kwasu mlekowego.
Boczny szlak prowadzący do glicerolu zwykle stanowi jedynie niewielką część metabolizmu węglowodanów. Pyke (1965) odnotował 0,25% wag./obj. w zacierze zbożowym, znacznie powyżej poziomów wyższych alkoholi i estrów, ale lotność gliceolu jest zbyt niska, aby pojawił się on w destylacie. Kongenerami smakowymi wytwarzanymi bezpośrednio przez główną drogę szlaku EMP są kwas pirogronowy i aldehyd octowy, ale wiele innych kwasów, alkoholi i estrów wytwarzanych jest jako produktu uboczne biosyntetycznej aktywności drożdży (tabela 4.1). Jednak większość tych kongenerów smakowych to produkty uboczne biosyntezy lipidów, kwasów nukleinowych i białek, co pokazane zostanie w dalszej części tego rozdziału.
EMP jest tylko jedną z możliwych ścieżek dostarczającego energii metabolizmu węglowodanów, ale jest ważnym szlakiem przemian w beztlenowych warunkach fermentacji. Hough i in. (1982) dostarczyli adekwatnego opisu szlaku monofosforanu heksozy (lub monofosforanu pentozy), cyklu Krebsa i innych aktywności metabolicznych istotnych dla aerobowego wzrostu drożdży piwowarskich (a zatem także aerobowego rozmnażania drożdży gorzelnianych), ale bardziej szczegółowe wyjaśnienia można znaleźć w dowolnym podręczniku biochemii.
Metabolizm azotu
Aminokwasy wymagane do wzrostu drożdży powstają w wyniku hydrolizy białek słodu podczas słodowania, a ilość azotu a-aminokwasowego w brzeczce jest częściowo związana ze stopniem modyfikacji słodu. Im wyższa zawartość azotu a-aminokwasowego w brzeczce, tym większy wzrost drożdży (ostatecznie powyżej około 150-180 mg/l), co zmniejsza wydajność alkoholu przez większe zużycie cukru do budowy masy komórek drożdży zamiast etanolu. Wyższe poziomy azotu oznaczają również proporcjonalnie niższą zawartość węglowodanów w jęczmieniu i słodzie. Biorąc pod uwagę stosunkowo niską zawartość azotu w kukurydzy i pszenicy, jest mało prawdopodobne, aby stanowiło to problem w gorzelniach zbożowych, a wyższa zawartość azotu w jęczmieniu jest zwykle związana z wyższą aktywnością enzymów - ważną dla gorzelni zbożowej własnością słodu.
Niemożliwe jest, aby ograniczona przestrzeń błony komórkowej drożdży zawierała indywidualne enzymy permeazy dla każdego z dwudziestu aminokwasów budujących białka. Tylko kilka aminokwasów ma określone enzymy transportowe, a większość z nich musi się dzielić. Chociaż kilka aminokwasów budujących białka nie zostało wymienionych przez Jonesa i Pierce'a (1964) ani Pierce'a (1987), to w tabeli 4.3 pokazano porównanie szybkości wychwytu poszczególnych aminokwasów - w rzeczywistości podsumowanie ich systemów transportowych. Tylko kwas asparaginowy/asparagina, kwas glutaminowy/glutamina i lizyna mają swoje własne specyficzne enzymy transportowe. Ponieważ arginina, seryna i treonina mają wspólną pojedynczą permeazę, szybkość i ilość wychwytu każdego pojedynczego aminokwasu jest w przybliżeniu proporcjonalna do ich względnych ilości w brzeczce, ale wszystkie są absorbowane z brzeczki z wystarczająco dużą szybkością, aby spełnić wymagania rosnącej komórki dla tych aminokwasów. Prolina i hydroksyprolina są wchłaniane tylko powoli, ale spełniają wymagania komórki w trakcie fermentacji. Jednakże, ponieważ wszystkie aminokwasy wymienione jako "grupa B" mają wspólną pojedynczą permeazę, nie są one absorbowane w wystarczającej ilości, aby spełnić wymagania syntezy białka podczas aktywnego wzrostu drożdży. Wszystkie aminokwasy mogą być transportowane przez ogólną permeazę aminokwasową (GAP), ale jest ona nieaktywna, gdy działa specyficzny transport aminokwasów grupy A i B. Zatem aminokwasy wymienione jako grupa C, których transport jest całkowicie zależny od GAP, mogą być absorbowane dopiero późno w fermentacji, zbyt późno aby mogły być włączone bezpośrednio do struktury enzymu podczas fazy aktywnego wzrostu. Aby rozwinąć nowy pączek, rosnąca komórka drożdżowa musi zsyntetyzować swój własny materiał komórkowy z substancji odżywczych w brzeczce. Do tej aktywności biosyntetycznej wymagane są wszystkie aminokwasy z grupy C oraz niezbędny dodatek ograniczonego wychwytu z grupy B. Ponieważ lizyna nie może być wykorzystana w tym celu przez gatunek Saccharomyces, grupy aminowe kwasu asparaginowego/asparaginy i kwasu glutaminowego/glutaminy dostarczają azotu aminowego do biosyntezy innych aminokwasów.
tab. 4.3
ryc. 4.5
Ryc. 4.5 pokazuje proste podsumowanie powstawania różnych pośrednich ketokwasów wymaganych do syntezy aminokwasów. Chociaż reakcje enzymatyczne są zwykle odwracalne, niektóre etapy biosyntezy ketokwasów nie są. Jeśli podaż azotu aminowego zostanie wyczerpana, oczywiście ketokwasy nie mogą zostać przekształcone w zamierzone aminokwasy. Jednak ketokwasy stanowią cenny surowiec, którego nie można akumulować w warunkach beztlenowych. Stąd jeśli nie można ich przekształcić w aminokwasy, ketokwasy są dekarboksylowane do odpowiedniego aldehydu i redukowane do alkoholu przez reakcje analogiczne do metabolizmu pirogronianu do etanolu. Ogólna dehydrogenaza alkoholowa redukuje aldehyd do odpowiedniego alkoholu, chociaż dla każdego ketokwasu wymagana jest specyficzna dekarboksylaza. Dlatego, jeśli ubytek azotu uniemożliwia przekształcenie kwasu a-keto-izokapronowego w leucynę, powstaje zamiast niego alkohol izoamylowy (ryc. 4.6). Ta zależność między aminokwasami i wyższymi alkoholami została po raz pierwszy zauważona przez Ehrlicha w 1911 roku, ale reakcje nie zostały w pełni wyjaśnione aż do lat 50 XX wieku. Możliwe jest również, że nawet pomimo dostępności azotu aminowego drożdże mogą przekształcić część swojej rezerwy ketokwasów w wyższe alkohole, aby wytworzyć utleniony NAD. Ta odpowiedź na problem utleniania-redukcji jest analogiczna do reakcji powstawania glicerolu ścieżką Embden-Meyerhof-Parnas, gdzie szlak pirogronianu jest dokładnie zrównoważony w NAD i generuje zysk ATP a szlak glicerolu jest zrównoważony pod względem ATP i zapewnia zysk utleniononego NAD do wykorzystania w reakcjach biosyntetycznych w warunkach beztlenowych.
ryc. 4.6
Diacetyl jest kolejnym produktem ubocznym metabolizmu azotu. Ryc. 4.7 pokazuje, że izobutanol jest alkoholem wyższym związanym z biosyntezą waliny, ale acetylomleczan, związek pośredni w szlaku biosyntezy, jest dekarboksylowany i redukowany do acetoiny i 2,3-butanodiolu przez reakcje podobne do tworzenie etanolu. Jednakże, ślady tych trzech związków wydalane do zacieru mogą zostać utlenione w nieenzymatycznych reakcjach chemicznych do diacetylu, na przykład za pomocą tlenu atmosferycznego rozpuszczonego przez turbulencję podczas napełniania kotła, lub przez napowietrzenie zacieru przy destylacji ciągłej. Ponieważ reakcje chemiczne są przyspieszane przez wyższą temperaturę, konwersja do diacetylu przebiega szybko we wczesnych etapach destylacji. Przy swoim niskim progu aromatu (około 1 ppm) i podobnej lotności do etanolu, diacetyl jest najważniejszym kongenerem pokazanym na ryc. 4.7 i jest jednym z niewielu związków, których nie można całkowicie usunąć z neutralnego spirytusu.
ryc. 4.7
Powstawanie kwasów tłuszczowych i estrów
Estry reprezentują inną grupę kongenerów smakowych powstających podczas fermentacji. Chociaż nieenzymatyczna estryfikacja kwasów i alkoholi jest ważną częścią rozwoju smaku podczas dojrzewania whisky, reakcja ta jest zbyt wolna, aby odpowiadać za estry wytworzone podczas fermentacji. Wytwarzanie estrów jest związane z odtwarzaniem kofaktora enzymu, koenzymu A (CoA). Kwas octowy i długołańcuchowe kwasy tłuszczowe są ważnymi produktami pośrednimi w biosyntezie, ale część tych związków jest tracona przez odpływ do zacieru, gdzie pojawiają się jako kongenery smakowe (tabela 4.1). AcetyloCoA i jego wyższe homologi, wspólnie określane jako R-CO~SCoA na ryc. 4.8, są ważnymi produktami pośrednimi w biosyntezie białek enzymatycznych, kwasów nukleinowych i lipidów. Warto zauważyć nietypowe usunięcie dwóch grup fosforanowych z ATP (z wytworzeniem adenozynomonofosforanu) [na ryc.4.8 jest literówka, zamiast „ATP – > ATP + (PP)” winno być „ATP – > AMP + (PP)” - przyp. tłum.] w przenoszeniu wysokoenergetycznego wiązania z ATP do kompleksu CoA. Jeśli jednak acetylo- lub acylo-CoA nie jest potrzebny, CoA musi być odtworzony dla odzyskania energii reprezentowanej przez wiązanie ~ i dla utrzymania ograniczonego wewnątrzkomórkowego zasobu samego CoA. Po usunięciu CoA grupa kwasowa jest stabilizowana przez estryfikację przy udziale enzymu esterazy (esterazy katalizują reakcję w obu kierunkach).
ryc. 4.8
Ponieważ kwas octowy i etanol to kwas i alkohol powstające w największych ilościach podczas fermentacji, naturalnie octan etylu jest głównym estrem pod względem ilości, chociaż inne estry z niższym progiem aromatu mają większy wpływ na zacier, alkohol i końcową whisky. Szersze implikacje odtwarzania CoA przedstawiono na ryc. 4.9, który wskazuje źródła etanolu, wyższych alkoholi i różnych grup kwasowych zaangażowanych w produkcję estrów.
ryc. 4.9
Metabolizm siarki
Podobnie jak w piwowarstwie i winiarstwie, również w gorzelnictwie w powstawaniu związków siarki szczególne znaczenie mają dwa typy reakcji: biosynteza aminokwasów siarkowych (ryc. 4.10) oraz redukcja siarczanów z brzeczki. Destylacja różni się od innych procesów korzystnym działaniem miedzi z której zbudowane są aparaty destylacyjne, ale przy normalnym stosunku powierzchni miedzi do pojemności kotła, niemożliwe jest (i niepożądane) całkowite usunięcie związków siarki.
ryc. 4.10
Biosynteza cysteiny i metioniny powoduje analogiczne problemy związane ze smakiem jak biosynteza innych aminokwasów, ale w tym przypadku problemy są bardziej poważne z powodu niższego progu aromatu wielu zawierających siarkę produktów ubocznych. Innym źródłem siarkowych off-flavours jest redukcja SO42- do S2- w trakcie fermentacji. Znaczna część powstającego siarkowodoru jest usuwana w wyniku wydzielania się dwutlenku węgla podczas fermentacji, a zatem stanowi głównie problem w gromadzeniu dwutlenku węgla spożywczego, ale wystarczająca ilość siarkowodoru i organicznych związków siarki może pozostać w zacierze, aby wpłynąć na jakość destylowanego alkoholu.
Metabolizm tlenu
Odkrycie przejścia między fermentacją a oddychaniem poprzez cofnięcie lub przywrócenie dopływu powietrza przypisywane jest Ludwikowi Pasteurowi chociaż istnieją teraz pewne wątpliwości, czy to faktycznie było jego odkrycie. Jest jednak z pewnością prawdą, że fakultatywnie beztlenowe bakterie szybko dostosowują się z metabolizmu oksydacyjnego do fermentacyjnego w zależności od obecności lub braku tlenu atmosferycznego. Sytuacja z drożdżami jest bardziej złożona.
Po pierwsze, drożdże z gatunku Saccharomyces i inne drożdże fermentacyjne nie mogą rosnąć w nieskończoność w warunkach beztlenowych bez pewnych składników odżywczych, które są im niepotrzebne w warunkach tlenowych. Sterole i nienasycone kwasy tłuszczowe, podstawowe składniki błon komórkowych drożdży (a także wszystkich organizmów eukariotycznych), nie mogą być syntetyzowane beztlenowo, co ogranicza beztlenowy wzrost drożdży do dwóch lub trzech pokoleń, o ile te związki nie występują w pożywce hodowlanej (brzeczce). Po drugie, drożdże fermentacyjne nie są prawdziwymi fakultatywnymi beztlenowcami, ponieważ pierwszeństwo ma efekt Crabtree. Powyżej około 1% fermentowalnego cukru w pożywce hodowlanej (dokładny procent różni się pomiędzy szczepami) drożdże fermentują przez metabolizm beztlenowy bez względu na to, jak dobrze napowietrzono pożywkę hodowlaną. Zamiast tego, rozpuszczony tlen jest wykorzystywany do biosyntezy błonowych kwasów tłuszczowych i steroli, umożliwiając w ten sposób bardziej obfity ilościowo wzrost gdy warunki tlenowe nie są już dostępne. Dlatego, mimo że celowe dodawanie nienasyconych kwasów tłuszczowych i steroli do brzeczki w celu zachęcenia drożdży do wzrostu jest niedozwolone w fermentacji szkockiej whisky, ten sam efekt można uzyskać legalnie przez napowietrzenie brzeczki.
W artykule opisującym częściowo własne doświadczenia, ale także obszernie przeglądającym literaturę dotyczącą efektów Pasteura i Crabtree, O'Connor-Cox i wsp. (1996) stwierdzili, że z rozpuszczonego tlenu obecnego w brzeczce na początku fermentacji browarniczej, tylko około 30% zostało użyte bezpośrednio do syntezy nienasyconych kwasów tłuszczowych i steroli. Stwierdzono, że tlen rozpuszczony w brzeczce nie jest wykorzystywany do tlenowego metabolizmu cukrów. W rzeczywistości reszta rozpuszczonego tlenu wykorzystywana jest do przywracania zdegenerowanych mitochondriów beztlenowych komórek drożdży do stanu w pełni funkcjonalnego wymaganego do syntezy lipidów, a być może także do syntezy innych niezbędnych czynników wzrostu. W ciągu kilku godzin zawartość rozpuszczonego tlenu w brzeczce spada do zera, a mitochondria powracają do stanu zdegenerowanego związanego z warunkami beztlenowymi. Jednakże, O'Connor-Cox i wsp. (1996) stwierdzili, że bez okresu pełnej funkcji mitochondrialnej nie może nastąpić późniejsza fermentacja. Ekstrapolując te obserwacje do szkockiej whisky, fermentacja z pewnością wymaga napowietrzania, ale czysta kultura hodowanych tlenowo drożdżowy, które już w pełni rozwinęły mitochondria, powinna w razie potrzeby być w stanie przeprowadzić zadowalającą fermentację bez napowietrzania. Mimo to jest prawdopodobne, że fermentacja przebiegałaby inaczej z napowietrzaniem i bez napowietrzania. [ciężko to przetłumaczyć słowo w słowo, w naszych warunkach chodzi o to, że napowietrzanie jest korzystne gdy tylko uwadniamy suche drożdże, natomiast starter z mieszadła powinien poradzić sobie nawet z brzeczką nie napowietrzoną – przyp. tłum.]
Podsumowanie produkcji aromatu podczas fermentacji
W browarach zmiana składu brzeczki ma istotny wpływ na profil smakowy piwa, ale ta opcja nie jest legalnie dostępna dla gorzelników szkockiej whisky. Inne zmienne fermentacji, o których wiadomo, że wpływają na smak piwa, są istotne dla fermentacji szkockiej whisky, chociaż możliwości celowego manipulowania smakiem są bardziej ograniczone. Na produkcję smakowych kongenerów wpływają następujące czynniki:
Właściwości genetyczne szczepu drożdży
Stan drożdży podczas dodawania do brzeczki (żywotność i witalność)
Ilość inokulum drożdżowego
Początkowe napowietrzanie brzeczki
Profil temperatury podczas fermentacji
Skażenie mikrobiologiczne.
tab. 4.4
Podsumowanie wpływu warunków fermentacji na wytwarzanie kongenerów smakowych przedstawiono w tabeli 4.4. Temperatura fermentacji ma istotny wpływ i była szeroko badana w kontekście fermentacji browarniczych w latach 60. i na początku lat 70. XX wieku. Generalną zasadą jest to, że wzrost temperatury fermentacji zwiększa stosunek ilości drożdży do dostępnego azotu a-aminokwasowego, co prowadzi do zwiększonej produkcji wyższych alkoholi. Zwiększony wzrost drożdży oznacza zmniejszenie odtwarzania CoA, co zmniejsza produkcję estrów.
Chociaż w odróżnieniu od browarów utrzymywanie stałej temperatury fermentacji nie jest typową praktyką gorzelniczą, stałe poziomy kongenerów smakowych w brzeczce wymagają spójnych profili temperaturowych podczas kolejnych fermentacji, co osiąga się przez ocenę prawidłowej temperatury początkowej brzeczki dla temperatury otoczenia.
Właściwości genetyczne drożdży wpływają również na produkcję kongenerów smakowych. Żadne dwa szczepy nie reagują identycznie na temperaturę fermentacji, zawartość rozpuszczonego tlenu i azotu aminowego (organicznego) w brzeczce. Dlatego też zmiana na inną kulturę może wpłynąć na smak brzeczki i ostatecznie na alkohol i whisky. Ponieważ aromat "estrowy" stał się pożądaną cechą, Hay i in. (1994) opracowali drożdże o wyższej wydajności poprzez manipulację genetyczną. Jednakże przy obecnym publicznym antagonizmie wobec organizmów zmanipulowanych genetycznie jest mało prawdopodobne, że takie drożdże będą wykorzystywane komercyjnie w niedalekiej przyszłości do generowania wyższych poziomów estrów w whisky, nawet jeśli są zgodne z przepisami whisky szkockiej.